Vettori per terapia genica

VETTORI PER TERAPIA GENICA

Per trasferire il transgene nella cellula bersaglio è necessario disporre di un sistema in grado di veicolarvi all’interno il DNA, cioè un vettore.

Esistono due grandi categorie di vettori che consentono il trasferimento genico:

  •   vettori non virali: si basano sull’uso di DNA, da solo o complessato a molecole che ne facilitino l’ingresso nella cellula
  •  vettori virali: si basano sull’utilizzo di virus opportunamente modificati in modo tale da poter veicolare il loro genoma all’interno delle cellule bersaglio, senza dare malattia (retrovirali, adenovirali, herpes simplex, adenoassociati)

vettori-non-virali

 

 

 

 

 

I virus, sono entità esistenti in natura specializzate nel trasferimento di informazione genetica nelle cellule. Per questa ragione si è pensato di sfruttare questa loro peculiarità adattandola alle opportune necessità. A differenza dei virus, infatti, i vettori da essi derivati non sono in grado di portare a termine un’infezione produttiva in seguito all’introduzione del materiale genetico (trasduzione) non avviene la replicazione e la propagazione del vettore. Tuttavia durante l’evoluzione gli organismi hanno sviluppato barriere fisiche e biologiche, quali le membrane cellulari, il complesso sistema immunitario, per evitare proprio l’introduzione di materiale genetico esogeno al loro interno da parte dei virus. Questo rappresenta un’ulteriore difficoltà da tenere in considerazione nello sviluppo e nell’applicazione dei vettori virali.

vettori-virali

I vettori virali attualmente utilizzati sono derivati da retrovirus, adenovirus, virus adenoassociati ed herpes virus, inoltre questi vengono suddivisi ulteriormente in integranti, per la loro capacità di integrare il loro genoma nel genoma della cellula ospite (retrovirus e adenoassociati), e non integranti (adenovirus e virus erpetici).

Il costrutto di un vettore virale prevede la delezione parziale o totale di alcuni geni virali solitamente responsabili dell’attività patologica o di attività accessorie, quindi non indispensabili per l’inserimento del transgene nella cellula. L’eliminazione di parti del genoma virale originale consente anche di avere maggior spazio a disposizione per inserire la cosiddetta “cassetta di espressione” (contenente il transgene e possibilmente un promotore che guidi la sua espressione).

Non esiste un vettore ideale adatto per ogni situazione, ma ognuno di essi è caratterizzato da vantaggi e svantaggi da prendere in considerazione di volta in volta, in relazione alle caratteristiche della patologia da trattare.

VETTORI00

I Retrovirus sono classificati in 7 subgeneri: alfa, beta, gamma, delta e epsilon- retrovirus, più i lentivirus e gli spumavirus. I Gammaretrovirus, conosciuti come oncoretrovirus, (ad es.: murine leukaemia viruses (MuLV), feline leukaemia virus (FeLV), e gibbon ape leukemia virsus (GALV)) sono stati per 12 anni i virus più utilizzati per lo sviluppo di vettori e per le applicazioni cliniche.

 

Fig. 1 Fasi della trasduzione mediata da vettori retrovirali.

Fig. 1 Fasi della trasduzione mediata da vettori retrovirali.

 

 Ilettore contenete il transgene attraversa la membrana plasmatica della cellula bersaglio. Il genoma virale a RNA viene rilasciato all’interno della cellula dove viene retrotrascritto in DNA a doppio filamento dalla trascrittasi inversa. Il pro-virus entra nel nucleo, si integra nel genoma della cellula ospite, dove utilizza i meccanismi propri della cellula e il transgene integrato viene trascritto in mRNA e tradotto in proteina come un normale gene cellulare.

 

I vettori retrovirali che derivano principalmente dall’oncoretrovirus Moloney Leukemia Virus (MoLV) sono stati tra i primi ad essere sviluppati, grazie alla relativa semplicità di costruzione, alla loro capacità di trasdurre un’ampia varietà di tipi cellulari integrandosi all’interno del genoma e alla loro non patogenicità per l’uomo. Questi vettori sono in grado di accogliere fino a circa 7Kb di DNA esogeno contenente il transgene. Nonostante questi vantaggi, la divisione cellulare è un requisito indispensabile per permettere a questi vettori di trasdurre la cellula e di integrare il genoma e questo limita il loro utilizzo a bersagli cellulari che naturalmente o artificialmente siano in attiva proliferazione.

Per ovviare a questo problema, sono stati realizzati dei costrutti derivati da lentivirus, come l’Human immunodeficiency virus (HIV). A differenza degli oncoretrovirus, per i quali la divisione cellulare rappresenta un requisito indispensabile per l’integrazione nel genoma della cellula infettata, i lentivirus hanno la capacità di integrare il proprio genoma in quello di una cellula ospite non in proliferazione, grazie alla capacità del provirus di attraversare la membrana nucleare. Progressive modifiche nella generazioni dei costrutti virali hanno permesso di ottenere un vettore lentivirale costituito da meno del 10% del genoma virale iniziale in cui sono presenti solo le sequenze necessarie a retrotrascrivere, trasferire ed integrare la cassetta di espressione nelle cellule bersaglio e sono assenti i geni per le proteine virali patogene.

La costruzione di questi vettori ha raggiunto buoni livelli di biosicurezza, grazie anche all’inattivazione del promotore virale originale presente nelle long terminal repeat (LTR). I vettori lentivirali hanno dimostrato una buona efficienza di trasduzione sia in vitro sia in vivo, affiancando alle qualità dei vettori basati su oncoretrovirus la capacità di trasdurre cellule non in attiva proliferazione, come ad esempio gli epatociti, le cellule muscolari e le cellule staminali emopoietiche.
I vettori retrovirali e lentivirali possono essere modificati geneticamente in modo da esprimere sul pericapside proteine di superficie diverse da quelle presenti nei virus parentali. Questa operazione è detta pseudotipizzazione. Le proteine dell’ “envelope”, legando differenti componenti proteiche delle cellule ospiti, determinano il tropismo del virus. Attraverso la pseudotipizzazione è possibile modificare il tropismo del vettore, ampliando o restringendo a seconda dello scopo da perseguire lo spettro d’ospite dei diversi tipi cellulari.

Uno svantaggio dei vettori derivati da virus integranti come MoLV o HIV è rappresentato dal fatto che l’integrazione nel genoma avviene in modo non controllato e questo può comportare fenomeni di mutagenesi inserzionale. E’infatti possibile che il vettore si inserisca all’interno di un gene cellulare essenziale, determinandone la perdita di funzione e la morte della singola cellula, oppure che il vettore si inserisca all’interno di geni oncosoppressori, inattivandoli, o in prossimità di protooncogeni, alterandone i profili di espressione e potenzialmente attivandoli in un contesto dove dovrebbero essere silenti. In quest’ultimo caso, la cellula contenente quella specifica integrazione potrebbe acquisire un vantaggio proliferativo sulle altre dando origine a una popolazione cellulare espansa più favorevole alla trasformazione tumorale. Questa evenienza, per quanto rara, è da tenere in attenta considerazione nella scelta di un protocollo di terapia genica. I vettori lentivirali di ultima generazione, a differenza dei loro predecessori (i vettori oncoretrovirali), rappresentano una promessa di cura per molte malattie genetiche.

vettori01

Principali preoccupazioni per quanto riguarda la produzione e l'uso clinico sono:

  •  la potenziale generazione di lentivirus competenti per la replicazione durante la produzione;
  • ricombinazione in vivo con sequenze lentivirali;
  • inserzione del DNA provirale vicino o all’interno di geni che possono innescare l’induzione di una cancerogenesi.

 PROGETTAZIONE DI VETTORI LENTIVIRALI (VL)

Devono essere impiegati tutti i mezzi possibili per ridurre la patogenicità associata con l’uso di lentivirus wild-type (WT), nella produzione di VL e ridurre al minimo i rischi connessi con il loro uso.
Questo si può ottenere utilizzando:

  • "genomi lentivirali minimi " attraverso l'eliminazione dei geni lentivirali per la virulenza o accessori
  • separazione dei geni / sequenze lentivirali essenziali per la costruzione del VL in opportune costrutti / cassette che riducono al minimo la possibilità di generazione di Lentivirus Competenti per la Replicazione (RCL).

Attualmente la maggior parte dei processi di produzione VL impiega almeno tre plasmidi:

  1.  un costrutto envelope, vettore di pseudotipizzazione, che esprime una proteina envelope virale eterologa, ad esempio, la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), per sostituire la proteina envelope omologa lentivirale;
  2. un costrutto helper, o due costrutti di packaging codificanti uno le proteine virali (Gag e Pol) necessarie in trans, l’altro contenente Rev sotto il promotore del Sarcoma di Rous. Tali plasmidi sono difettivi per il segnale di packaging, per tutti i geni accessori e per il gene tat;
  3. un costrutto che ospita il transgene, comprese le sequenze necessarie per la produzione e il packaging del vettore di espressione VL, comunemente denominato il costrutto “transfer”.

 Alternativamente, VL può essere realizzato utilizzando un costrutto che codifica per il transfer vector e una sola cassetta contenente i geni per l’envelope e il packaging, attentamente progettati per ridurre il rischio di ricombinazione. In particolare, le omologie di sequenza tra i costrutti transfer e packaging (envelope e helper) sono ridotte al minimo per prevenire eventi di ricombinazione.

 Il problema della biosicurezza è fondamentale nella valutazione di impiego di MOGM e per garantirla i vettori lentivirali hanno subito nel tempo successive modifiche, sino a giungere alla costruzione dei vettori di 3° generazione (Fig.2). Questi ultimi sono caratterizzati dall’assenza nel genoma della maggior parte dei geni coinvolti nella patogenicità.

 Vettore di terza generazione

 Self Inactivating (SIN) vector

 

  • LTR del ceppo WT presenti nel vettore di prima generazione, sono state sostituite dal promotore di un virus non correlato Citomegalovirus (CMV) o Virus Sarcoma di Rous (RSV)
  • ridotta probabilità di rigenerazione di RCL
  • ridotta mobilitazione del vettore e ricombinazione con il ceppo WT
  • separazione, in due costrutti di packaging indipendenti, dei geni rev e gag/pol e la sostituzione di segnali retrovirali di poliadenilazione
  • delezione di tutti i geni accessori e il gene rev è presente in una forma incompleta.

Tuttavia, tali modifiche non devono esse stesse introdurre nuovi rischi per la sicurezza e le performance del vettore. Sono necessari esperimenti in vitro e/o in vivo per valutare le caratteristiche del costrutto tra cui il rischio di generazione di Lentivirus Competenti per la Replicazione.

vettori-3-gen

 

 vettori03

  vettori5

 vettori4

 

I commenti sono chiusi

Utilizzando il sito, accetti l'utilizzo dei cookie da parte nostra. maggiori informazioni

Questo sito utilizza i cookie per fonire la migliore esperienza di navigazione possibile. Continuando a utilizzare questo sito senza modificare le impostazioni dei cookie o clicchi su "Accetta" permetti al loro utilizzo.

Chiudi